FITC Coniugazione Protocolli

November 23

FITC Coniugazione Protocolli


isotiocianato di fluoresceina, comunemente indicato come FITC - pronunciato "fit-C", per rima con "ditsy" - è un marcatore fluorescente che è legato chimicamente, o coniugati, ad altre molecole come le proteine ​​e anticorpi. Un anticorpo coniugato con FITC potrebbe anche essere definito come un "anticorpo marcato con FITC." FITC è eccitata da luce ad una lunghezza d'onda di 488 nm ed emette energia fluorescente rilevata a 530 nm. Uno scienziato può vederlo con una fluorescente apparecchiature microscopio o uso che rileva le emissioni fluorescenti e li registra.

metodi

FITC coniugazione segue un protocollo di base. Ad esempio, FITC e un anticorpo sarebbero mescolati insieme in un certo rapporto in una provetta e ruotati a temperatura ambiente per un'ora. Per rimuovere il non legato FITC dalla soluzione, viene versata su una colonna di cromatografia di affinità - un tubo di vetro riempito con un gel tallone-like che legherà il coniugato FITC. Nel frattempo, l'anticorpo marcato con FITC fluirà attraverso la colonna e viene raccolto per l'uso.

considerazioni

Prima di iniziare una coniugazione, il ricercatore dovrebbe prendere in considerazione diversi punti. Innanzitutto, FITC è altamente instabile e non deve essere esposta alla luce - va tenuto in tubi stagnola sempre coperto. In secondo luogo, il tempo di coniugazione e la temperatura possono essere alterati per una proteina sensibile alla temperatura. Infine, diverse proteine ​​e anticorpi possono avere capacità differenti FITC vincolante, in modo da trovare il corretto rapporto di anticorpi FITC è critica; troppo poco FITC rende un anticorpo non rilevabile e troppa può alterare la sua specificità. Per questo motivo, le coniugazioni preliminari su piccola scala in diversi rapporti di FITC per anticorpi devono essere installati in parallelo. Una volta che il rapporto ottimale è stabilito, la coniugazione larga scala può essere eseguita.

usi

I medici e gli scienziati utilizzano anticorpi coniugati con fluoresceina, ormoni e fattori di crescita in una vasta gamma di test e applicazioni. Per esempio, una cellula staminale trovata nel sangue ha una molecola sulla sua superficie chiamato CD34. Un tecnico di laboratorio può mescolare il sangue di un paziente con un anticorpo marcato con FITC specifico per CD34, ed eseguire le cellule attraverso un citometro di flusso che utilizza un raggio laser per rendere la fluorescenza FITC. Successivamente, il citometro separa le cellule CD34 fluorescenti dal resto delle cellule del sangue, e medici possono utilizzare queste cellule staminali isolate per trattamenti terapeutici.